2019-07-02 中華兒科雜志

作者：中國醫師協會醫學遺傳醫師分會 中華醫學會兒科學分會內分泌遺傳代謝學組 中國醫師協會青春期醫學專業委員會臨床遺傳學組 上海市醫學會分子診斷專科分會

遺傳病是指由于基因或基因組的結構或功能改變所導致的疾病。下一代測序（next-generation sequencing,NGS）是遺傳病檢測領域的一項革新性技術。近年來靶向測序和全外顯子組測序（whole exome sequencing,WES）得到廣泛認可，逐漸成為輔助醫生進行遺傳病診斷的重要工具。這些檢測手段盡管有效，仍然存在一些技術限制，特別是在檢測結構變異（structural variations,SV）等方面。全基因組測序（whole genome sequencing,WGS）有望進一步提升臨床遺傳檢測的效能。WGS對受檢者基因組中的全部DNA序列進行檢測，較WES所覆蓋的區域更廣，不僅覆蓋了幾乎全部基因的外顯子序列，也覆蓋了內含子序列和基因間序列。現在認為WGS可有效避免在對相關基因組區域進行靶向富集時產生的技術偏差，不僅可以檢出單核苷酸變異（single nucleotide variations，SNV），還可以對SV進行分析，并常規性地對線粒體基因組（mitochondrial genome DNA,mtDNA）變異進行分析。同時其操作步驟相對簡化，能更加快速地獲得更完整的基因組信息。因此，WGS應用于臨床遺傳診斷有望提高診斷率，縮短診斷流程，節省時間及降低診療費用。

由于WGS產生的數據涉及受檢者的幾乎全部遺傳信息，其應用于臨床遺傳病檢測需遵循醫學倫理中的自愿、患者受益、不傷害和公平原則。為了實現其應有的臨床意義，并妥善處理檢測可能帶來的復雜遺傳咨詢問題，本共識列出了WGS作為遺傳病診斷檢測手段的關鍵特征，并在檢測申請、檢測及分析流程、報告及遺傳咨詢等方面給出建議，但其實施流程及效能驗證的具體步驟不在本共識的涵蓋范圍。本共識適用于以NGS技術為主的高覆蓋度WGS（通常>40X）在遺傳病臨床診斷性檢測中的應用，主要針對符合孟德爾遺傳規律的基因或基因組疾病。對于WGS在預測性檢測、篩查等場景中的應用，不在本共識的討論范疇。

一、送檢目的及臨床適應證

1．送檢目的：

本共識認為WGS可用于以下送檢目的，（1）臨床診斷不明但懷疑為遺傳病的患者，通過WGS尋求相關的分子診斷和鑒別診斷；（2）臨床診斷明確的遺傳病患者，為進一步指導治療或生育尋求分子水平的確診。

2．臨床適應證：

WGS適用于懷疑遺傳病是患者全部或部分癥狀原因的所有情況。（1）推薦WGS，①高度懷疑患者有遺傳病的可能（如臨床癥狀、體征和其他檢測結果提示，家族史陽性或近親結婚家系），但先前經過如染色體核型、微陣列芯片或全外顯子組測序等一種或多種遺傳學檢測未獲得明確的分子診斷；②患者表型為非特異性[不明原因的智力落后和（或）發育遲緩、非已知綜合征的多發畸形等]或臨床診斷明確但目標疾病遺傳異質性高（先天性白內障、腓骨肌萎縮癥、腦白質病等），為獲得時間或經濟效益而尋求一次性、全面性的遺傳學檢測（新生兒重癥患兒等）。（2）可使用WGS，但應結合具體情況選擇優先的檢測方法：目標疾病遺傳異質性低，雖已有公認的靶向檢測方法，但有可能部分致病變異（非編碼區變異等）不在靶向檢測的范圍（神經纖維瘤1型等）。（3）不推薦使用WGS，①目標疾病致病基因的相當一部分變異類型不在WGS檢測范圍，例如Beckwith-Wiedemann綜合征等基因印跡疾病；②目標疾病致病基因存在同源區域等情況，如先天性腎上腺皮質增生（CYP21A2基因相關）等。

二、檢測前咨詢

1．遺傳咨詢的必要性：

受檢者在進行WGS前，原則上應由接受過醫學遺傳學培訓的臨床醫生（含繼續教育）或遺傳咨詢師進行遺傳咨詢以明確檢測目的，了解檢測方法及其局限性，知曉預期結果和可能的風險，并知悉數據及樣本的相關處理。

2．檢測前遺傳咨詢及知情同意的內容：

在WGS檢測前進行遺傳咨詢有助于受檢者充分知情，建議以書面的形式獲得受檢者或其監護人簽署的知情同意書。遺傳咨詢及知情同意的內容應包括：（1）送檢的目的及意義；（2）檢測方法、周期及局限性；（3）預期結果及可能的風險：檢測結果可能為陽性，即在與受檢者表型相關的基因中找到致病性變異；陰性，即未發現與受檢者表型相關的致病性變異；或結果不確定，即在與受檢者表型相關的基因中找到意義不明的變異，或在與受檢者表型可能相關但是不確定的基因中找到致病性變異。受檢者應知悉次要發現的可能及其意義和風險，確認"不知權"。檢測過程中及知曉結果后，受檢者可能會出現不同程度的精神壓力和心理負擔；（4）數據及樣本處理的相關規則；（5）數據再分析的可能性。

三、檢測流程

1．信息和樣本采集：

檢測前應收集盡可能詳細的表型信息。表型信息包括臨床癥狀、體征、實驗室檢查、病理檢查和影像學及其他檢查結果等。建議使用人類表型標準用語（human phenotype ontology，HPO）或中文人類表型標準用語（China human phenotype ontology，CHPO）等統一術語。家族史信息收集建議達到三代或三代以上，對于家族史陽性的，應詳細記錄每個患者的表型信息，含發病年齡、輕重程度等。臨床醫生與實驗室和受檢者溝通后，可以在缺乏部分輔助檢測結果的情況下先提供WGS檢測，然后在結果分析時或分析后針對性地對患者進行檢查。樣本采集應按實驗室要求，采集含基因組DNA的生物樣本，包括但不限于全血、組織、培養的細胞等。

2．標準操作程序（standard operating procedure,SOP）的建立及檢測性能確認：

檢測機構需建立符合相關規定的SOP。此SOP需對每一個環節的質控和操作關鍵參數有明確界定。檢測性能確認時建議采用國際通用的標準樣本，以已確認的變異為對象，分析界定其對不同變異類型的敏感性、特異性，并對檢測性能的穩定可靠性做批間、批內的差異分析，界定可接受和可報告的范圍。應遵循SOP進行檢測及質控。操作流程中的重要成分或處理方法有改變時應對檢測性能進行再次確認，并記錄與原SOP的主要差別和改進。實驗室SOP及其性能確認報告應為含有效期和版本號的書面文本，以備培訓、操作時參閱和檢查時展示遞交。

3．確認性實驗：

用于診斷目的的變異檢測結果，建議經過確認性實驗后報出。確認性實驗目的一為排除樣品混淆等人為錯誤，二為排除變異的假陽性。（1）樣本真實性的追蹤及確認。為了排除樣本混淆的風險，實驗室應建立樣本追蹤方案，如通過單核苷酸多態性（SNP指紋圖譜）來確認送檢樣本與數據相符。（2）用于診斷目的的變異確認。對于SNV、拷貝數變異、SV和mtDNA變異，可以根據涉及變異的位置和特性選擇適合的方法進行確認，如Sanger測序確認SNV、微陣列芯片或多重連接探針技術等確認拷貝數變異、核型分析和熒光原位雜交等確認SV、特異性高的mtDNA檢測確認線粒體基因組變異。對變異進行確認性實驗時，應考慮到不同方法間靈敏度的差異，如WGS可檢出等位基因頻率占比低的嵌合性變異，但此類變異可能無法通過Sanger測序檢出及確認。（3）對新發變異應通過父母親源關系檢測確認。

4．檢測的局限性：

WGS檢測的局限性主要包括，（1）涉及高度重復或同源的基因組區域的檢測及分析可能不準確。在染色體著絲粒DNA、著絲粒旁的異染色質、端粒、亞端粒區間或線粒體基因組等高度重復或同源的區間，較短的讀長在與參考基因組進行比對時可能存在不唯一性。這些區域還存在活躍的重組，也會增加比對難度。臨床常見的與高度重復或同源基因或基因組相關疾病包括耳聾（STRC基因相關），先天性腎上腺皮質增生（CYP21A2基因相關），Lynch綜合征（PMS2基因相關）等。（2）對于mtDNA變異識別存在局限性，需用特異性高的mtDNA檢測方法進行驗證。原因是線粒體基因組變異有雜質性的特點。準確區分同質性和雜質性，以及測定雜質性的水平對于線粒體基因組變異的分類有非常重要的意義。由于線粒體基因組存在大量與核基因同源的序列，WGS測序可能出現mtDNA變異假陽性、不能準確區分同質性和雜質性以及不能對雜質性進行準確定量的情況。（3）人類基因組參考序列僅來源于有限個體，部分基因組區域還存在參考序列的誤差和空白間隙，變異識別可能出現假陽性和假陰性。（4）鳥嘌呤和胞嘧啶（guanine and cytosine,GC）占比高區域的覆蓋可能不完全。WGS的覆蓋均一性雖較捕獲測序有顯著改善，但由于基因組構型的復雜性，高GC含量區域的變異評估應謹慎。（5）部分變異類型，如環狀染色體等復雜結構變異，WGS的檢出率及準確性仍有待進一步的確認。

值得一提的是，上述討論的局限性并非一成不變，由于技術及算法的改進，這些局限性相關的問題在將來可能得到解決，例如某些涉及高度同源基因的疾病已有通過NGS方法進行檢測的文獻報道。

四、檢測報告

檢測報告是其在臨床應用的重要依據。建議檢測機構參照2018年2月發表的"臨床基因檢測報告規范與基因檢測行業共識探討"，出具符合行業標準和規范的檢測報告。

1．報告發放的對象：

建議檢測報告先發給送檢者指定的有遺傳咨詢或臨床遺傳醫師資質的專業人員，考慮國情也可同時發放給送檢者（或其法定監護人、代理人）。

2．報告的形式及內容：

報告的形式須簡明扼要，所列內容定義明確，結果解讀依據充分，檢測報告的適用范圍和局限性須明確說明。檢測報告應包括如下主要方面，①一般信息：檢測單位或實驗室信息、受檢者信息、送檢單位和醫師信息、報告出具和簽發時間等。②檢測信息及局限性：包括檢測技術的范圍、方法的說明、局限性等具體描述。對于WGS檢測，應特別說明分析所包含的變異類型，如是否包含結構變異及線粒體變異等，以及是否采用其他方法對結果進行驗證。③檢測結果的報告、解讀和結論：建議報告與臨床表型相關的致病、疑似致病及意義不明變異。對于與臨床表型無關但有臨床意義的次要發現，依情況而定是否報告。應對檢測到的基因變異及其分類進行解讀，包括對致病性與否進行具體解釋，其所導致的相關疾病應進行簡單解釋和說明，并給出基于變異分類的報告結論。④遺傳咨詢和建議：報告應明確說明由具遺傳咨詢或臨床遺傳醫師資質的專業人員進行相應遺傳咨詢或下一步臨床決策。可在必要時對可能的遺傳咨詢提出建議，如根據獲得的臨床信息或其他相關信息進一步明確遺傳變異致病相關性的建議。

五、檢測后遺傳咨詢

無論何種檢測結果，均應給予受檢方相應的檢測后遺傳咨詢，就檢測的意義及結果進行解釋和教育，輔導其進行知情選擇，使其對所患疾病及其再發風險有所認知和接受，并提供有關的治療、求助渠道等信息。

咨詢內容包括是否可就檢測結果做出明確的基因診斷；是否需要針對性的輔助檢查來進一步明確檢出變異的致病相關性，尤其是對意義不明的變異；是否需要進一步對受檢者或家庭成員進行檢測驗證或排除診斷；根據基因檢測結果，是否需進行適當的治療干預，調整治療方案或飲食，明確藥物禁忌等；根據做出的基因診斷對患者的病情預后發展等進行評估，制定治療及隨訪觀察計劃、并發癥的預防干預；對患者和家屬提供心理干預或社會救助資源和渠道等；根據遺傳規律對父母的再生育風險的評估及其再生育指導，包括產前診斷或輔助生育計劃的方式等；患者或先證者的下一代風險評估及其再生育指導；家族內其他家庭成員的風險評估；疾病的有關研究進展信息等。需注意的是，如受檢方要求進行產前診斷或輔助生殖等，則需根據相關共識或指南明確告知風險，進行相應的指導或咨詢。

六、其他相關問題

1．次要發現：

WGS的主要目的是揭示可解釋患者臨床表型的致病基因（組）變異，但在部分個體基因組中還可能檢測出與受檢指征不相關但具有重要臨床功效性（主要是指能較好預測未來發病的可能并可進行預防性干預或治療）的基因（組）變異。當這些變異是無意中被發現時，曾被稱為意外發現。美國醫學遺傳及基因組專家委員會（American college of medical genetics and genomics,ACMG）建議有意識地分析這些有重要臨床意義的基因（組）變異，并將稱其為次要發現。ACMG建議對59個推薦的基因進行數據分析并根據患者的選擇意愿報告其中的致病性和可能致病性變異，建議對于意義未明的相關罕見變異不進行報告。本共識專家團隊原則上認可報告次要發現的臨床功效及意義，同時建議結合國情制定執行層面的政策和方案。具體建議如下，（1）應該為所有參與WGS檢測的患者（或家屬）提供有關次要發現的介紹，并在知情同意的情況下明確選擇是否接受報告次要發現。（2）ACMG推薦的59個基因可以作為分析和報告次要發現的主要對象，但需要在綜合考慮以下因素的情況下決定刪增基因及病種，①在中國人群中的發生頻率及外顯率；②目前醫療條件下提前干預治療或預防的可及性及有效性。（3）只對根據ACMG變異分析指南判定為致病性和可能致病性的變異進行報告。（4）建議對報告的次要發現進行跟蹤隨訪，以評估其實際的臨床功效，積累致病變異外顯率相關數據并以此為依據建立更新修改次要發現的報告原則、基因和疾病種數及報告內容的機制。基于核心家系的WGS測序能發現父母的近親關系和非親子關系，這也屬于一種檢測的意外發現，除非對患者的診斷治療有特別的必要性，建議不在檢測報告中體現這些信息。建議有遺傳咨詢資質的專業人員在檢測后的遺傳咨詢過程中酌情處理。

2．樣本及數據的處理：

（1）樣本及數據的保存，基因檢測的樣本及數據應由檢測機構長期保存（建議至少保存2年）。檢測機構應根據不同的樣本及數據類型選擇合適的保存方式。檢測機構可以在送檢知情同意書中約定保存的年限，若超過年限則可以自行銷毀或交由委托人自己保存。數據保存的考量應包括原始數據的可溯源性、現有技術（包括測序技術、遺傳變異位點處理技術）的版本可溯源性、基于目前知識注釋解讀的可溯源性。基于數據安全考慮，要實施必要的防火墻、加密和管理；基于患者隱私考慮，個人信息、醫療記錄和WGS數據要有效地分開管理。（2）樣本及數據的調用及所有權，檢測機構應建立樣本庫和數據庫，采用二級分層（檢索庫和匿名化的主庫）管理，調用樣本或數據需要設置流程并規范執行。因為樣本及數據涉及患者隱私，應對樣本及數據調用者進行必要的身份驗證，即僅提供給患者本人、法定監護人或獲得其書面授權的人員，并將調用樣本或數據的目的、時間、形式（如生物樣本的類型和數量等）、調用者信息及簽名等記錄在案。（3）數據的再分析，隨著基因組學技術的不斷發展，對基因（組）疾病的認識也在不斷更新和深入。建議檢測單位可應送檢者要求，根據自身情況制定相應的標準操作流程，對數據進行重新解讀和再分析。（4）數據共享，在基因或基因組疾病科研以及臨床應用飛速發展的大背景下，WGS數據共享是值得大力提倡、積極促進的。目標包括①鼓勵患者及家庭積極參與，以捐贈形式共享自身遺傳測序數據；②鼓勵科研人員、臨床醫生或醫院、檢測機構在保護隱私、保證數據安全、符合倫理知情同意等前提條件下共享測序數據；③科研成果按照行業慣例分享，形成正面良性循環。

3．研究與臨床診斷的界限：

由于WGS檢測的特殊性以及基因與疾病關聯性知識的快速更新，臨床檢測與科學研究的界限容易模糊。但鑒于檢測目的的不同以及臨床醫學的特殊性，WGS在臨床診斷和科學研究中的應用有清晰的區別。診斷性檢測是指為了直接解決患者醫療過程中的臨床問題進行的檢測，其目的是為臨床診治提供依據和指導，此類檢測應由經認可的臨床檢測實驗室完成，并限于已知與疾病相關的基因。其分析結果可以產生理論假設，在符合醫學倫理原則的前提下，可用作科學研究數據。

科學研究性質的檢測是指為了探索或者證明某種科學假說而進行的檢測，其結果對于參與研究項目的患者可能臨床意義有限。應該告知患者及家庭研究項目存在發現潛在遺傳病的可能性；若研究中發現臨床相關結果，應該經由診斷體系證實之后方可納入患者臨床病歷。

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